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黃曲霉毒素B1(Ⅱ型)ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
【概要】
黃曲霉毒素是曲霉菌屬的黃曲霉和寄生曲霉的二次代謝產(chǎn)物,是自然界最危險(xiǎn)的致癌物質(zhì)之一,廣泛存在于谷物、堅(jiān)果、棉籽以及以此為原料生產(chǎn)的各種食品、油料、酒類(lèi)、飼料中,并能通過(guò)動(dòng)物體產(chǎn)生同樣有害的代謝產(chǎn)物,存在于牛奶及奶制品,肉類(lèi)甚至人體血液,組織中。
黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的是黃曲霉毒素B1,是世界衛(wèi)生組織規(guī)定的I類(lèi)致癌物質(zhì),毒性是砒霜的68倍,其幾乎一直和黃曲霉毒素B2、G1 和 G2共存,是肝癌的三大致病因素之首。世界大部分國(guó)家和地區(qū)都已對(duì)食品和飼料中的黃曲霉毒素最高允許水平作了規(guī)定,因此,準(zhǔn)確測(cè)定食品及飼料中的黃曲霉毒素含量對(duì)于食品安全監(jiān)控具有重要意義。
【適用范圍】
可定性、定量檢測(cè)玉米、大米、麥類(lèi)、豆類(lèi)、花生、飼料等樣本中的黃曲霉毒素B1。
【試驗(yàn)原理】
本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA原理,在微孔板上預(yù)包被黃曲霉毒素B1抗原,加入樣本/黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素B1抗體。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的黃曲霉毒素B1與預(yù)包被在微孔板上的黃曲霉毒素B1抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的黃曲霉毒素B1抗體。未結(jié)合的酶標(biāo)抗體在洗滌時(shí)被除去。再加入TMB顯色液,讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物黃曲霉毒素B1的含量成負(fù)相關(guān)。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可得出相應(yīng)殘留物黃曲霉毒素B1的含量。
【試劑盒靈敏度】
試劑盒靈敏度:0.5ppb
【交叉反應(yīng)率】
結(jié)構(gòu)類(lèi)似物 交叉反應(yīng)率
黃曲霉毒素B1 …………………………………………………………… 100%
黃曲霉毒素B2 …………………………………………………………… 15%
黃曲霉毒素G1 …………………………………………………………… 11%
黃曲霉毒素G2 …………………………………………………………… 4%
黃曲霉毒素M1 …………………………………………………………… 0.5%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊
2. 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶:(2ml/瓶)
0ppb, 0.5ppb, 2ppb, 4ppb, 8ppb,16ppb
3. 酶標(biāo)物1瓶 ……………………………………………6ml
4. 顯色液1瓶 …………………………………………12ml
5. 終止液1瓶 …………………………………………10ml
6. 濃縮洗滌液 (10×)1瓶………………………… 50ml
7. 濃縮樣品稀釋液(10×)1瓶 ……………………50ml
【需要而未提供的設(shè)備及試劑】
設(shè)備:
┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm
┅┅振蕩器(可選)
┅┅粉碎機(jī)
┅┅離心機(jī)(可選)
┅┅天平:感量0.01g
┅┅微量移液器:?jiǎn)蔚?20μl~200μl、200μl~1000μl、八道300μl
試劑:
┅┅甲醇(分析純)
┅┅去離子水(或蒸餾水)
【試劑配制】
1. 樣品稀釋液:將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)?份濃縮樣品稀釋液+9份去離子水)。
2. 洗滌工作液:將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)?份濃縮洗滌液+9份去離子水)。
3. 70%甲醇水:將甲醇用去離子水按70:30體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)?份無(wú)水甲醇+3份去離子水)。
【樣本前處理步驟】
花生醬、芝麻醬、蛋黃醬、面粉、餅干、蛋糕等食品,各種飼料及花生粕、豆粕、麥麩、DDGS等原料(稀釋倍數(shù):5)
1. 取10g粉碎的樣品與50ml 70%甲醇水混合均勻(可根據(jù)提取容器,等比例適量調(diào)整樣品量和甲醇水的量);
2. 高速均質(zhì)2min或振蕩提取5min;
3. 2000g離心5min或定性濾紙過(guò)濾;
4. 取100μl上清液待測(cè)。
【檢測(cè)步驟】
一、 測(cè)定前須知:
1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫(20~25℃)。
2. 使用之后立即將所有試劑及剩余板條放置2~8℃,干燥環(huán)境保存有利于保持試劑穩(wěn)定性。
3. ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA操作中的要點(diǎn)。
4. 在所有恒溫孵育過(guò)程中,避免光線照射。用蓋板膜封住微孔板。
二、操作步驟:
1. 將所需試劑及微孔板取出,放置室溫(20~25℃)30min以上,液體試劑使用前均須搖勻。
2. 取出所需數(shù)量的微孔板,將不用的微孔板與干燥劑一起重新真空密封,放置于2~8℃。不可冷凍。
3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。
4. 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5. 每孔中加入60μl樣品稀釋液。
6. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本30μl到對(duì)應(yīng)的微孔中,加入酶標(biāo)物50μl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。
7. 小心揭開(kāi)蓋板膜,用洗滌工作液充分洗滌,300μl/孔,洗板5次,每次間隔30s,用吸水紙拍干。
8. 加入顯色液100μl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。
9. 加終止液50μl/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)酶標(biāo)儀于450nm處讀取每孔OD值。
【結(jié)果判定】
1. 百分吸光率的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光率(%)= B/B0 ×100%
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0(ppb)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素B1實(shí)際含量。
【注意事項(xiàng)】
1. 室溫低于20℃或試劑及樣本沒(méi)有恢復(fù)到室溫(20~25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2. 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3. 每種試劑使用前均需搖勻。
4. 反應(yīng)終止液為0.5M硫酸,避免接觸皮膚。
5. 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒;也不要摻雜使用過(guò)了有效期的試劑盒;盡量不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
6. 儲(chǔ)存條件:
試劑盒保存于2~8℃,不能冷凍,將不用的微孔板重新真空密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的顯色劑對(duì)光敏感,因此要避光保存。
7. 試劑變質(zhì)的跡象:
顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A450nm<0.5)時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。
8. 加入顯色液后,一般顯色時(shí)間為15~30min。若顏色較淺,可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到35min(或更長(zhǎng)),但不得超過(guò)40min。反之,則減短反應(yīng)時(shí)間。
9. 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
【樣品最低檢測(cè)限】
飼料等……………………………………… 5ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件:保存試劑盒于2~8℃。
保存期:該產(chǎn)品有效期為12個(gè)月。
電話(huà):4006-099-690 郵編:100081 傳真:010-62158706 公司地址:北京市海淀區(qū)學(xué)院南路68號(hào)吉安大廈A座6層